Il microbiota intestinale, termine che nel tempo ha sostituito quello più comune di microflora intestinale, è costituito da circa 10 alla14 batteri (500- 1.000 specie diverse), mentre il microbioma, ossia l’insieme dei geni del microbiota, è oltre 150 volte quello umano. Questo ecosistema, complesso e dinamico (il microbiota cerca di mantenere una composizione costante pur in presenza di condizioni ambientali e dietetiche variabili), svolge numerose funzioni importanti per il benessere del nostro organismo:
- lo protegge dall’aggressione dei germi patogeni;
- contribuisce allo sviluppo del sistema immunitario innato ed adattativo e al mantenimento della tolleranza immunitaria;
- regola la produzione di vitamine, in particolare B e K;
- produce, per fermentazione, acidi grassi a corta catena (acido acetico, butirrico e propionico) che fungono sia da nutrienti per i microrganismi che come segnali di stimolo per il sistema immunitario.
Alla nascita, il sistema immunitario del neonato sano è “naïve”; è solo durante la vita post-natale che l’esposizione agli antigeni promuove lo sviluppo e l’espansione di questo sistema. Nell’arco della nostra vita, la composizione del microbiota intestinale può essere influenzata da diversi fattori: il tipo di parto, naturale o cesareo, il tipo di alimentazione, al seno o artificiale, le terapie farmacologiche, etc. I neonati allattati al seno, ad esempio, hanno rispetto a quelli allattati artificialmente un microbiota più ricco in bifidobatteri, specie batteriche benefiche per il nostro organismo, in quanto il latte materno contiene oligosaccaridi ad azione prebiotica, ossia sostanze non digeribili in grado di stimolare in modo selettivo la crescita e l’attivazione di questi microrganismi con effetti di riequilibrio sulla microflora intestinale. Dallo svezzamento, momento in cui nella vita del bambino inizia l’introduzione di cibi solidi, la composizione del microbiota si arricchisce di nuove specie microbiche assumendo sempre di più l’aspetto che avrà nella vita adulta. La colonizzazione precoce dell’intestino è importante anche per lo sviluppo ed il mantenimento della tolleranza immunologica, ossia quel particolare meccanismo, in cui è coinvolto il GALT, ossia il tessuto linfoide associato all’intestino, che consente all’organismo di riconoscere come sostanze estranee inoffensive proteine antigeniche, prevenendo così lo sviluppo di patologie allergiche o di tipo autoimmune. Alcuni studi hanno dimostrato che il microbiota dei bambini atopici, ossia a rischio di sviluppare un’allergia IgE-mediata, contiene meno bifidobatteri e Staphylococcus aureus in maggior concentrazione. Una presenza nutrita di Escherichia coli e Clostridium difficile nell’intestino sono invece associati ad eczema e dermatite atopica, mentre un rapporto sbilanciato tra i generi Firmicutes e Bacteroides (da 3:1 a 35:1) sono tipici dei soggetti obesi. Una benefica composizione del microbiota intestinale serve inoltre a mantenere il corretto bilancio tra la risposta immunitaria dei linfociti Th1, che, grazie al coinvolgimento di IFN-γ e IL-12, svolge una funzione difensiva nei confronti di virus e batteri, e quella dei linfociti Th2 tipica delle malattie allergiche. Molte sono le evidenze scientifiche, che evidenziano un titolo anticorpale maggiore quando individui sani sottoposti a vaccinazione assumono per un certo periodo di tempo (pre e post vaccino) un alimento (es. yogurt) a base di microrganismi probiotici. L’efficacia dipende tuttavia dal ceppo assunto: il Lactobacillus casei NCC NCC 2461 and L. paracasei DN-114 001 hanno mostrato un effetto adiuvante in combinazione con il vaccino antinfluenzale nell’anziano, mentre il L. rhamnosus ATCC53103 e il L. fermentum CECT5716 si sono mostrati più efficaci nella popolazione adulta. In 16 volontari sani, che hanno assunto per 3 settimane uno yogurt contenente 10alla7-10alla8 UFC/ml di L. johnsonii CNCM I-1225, è stata determinata una concentrazione di IgAs maggiore in risposta al vaccino contro Salmonella typhimurium. I ceppi Bifidobacterium longum BL999 e L. rhamnosus LPR si sono invece dimostrati efficaci nel migliorare la risposta immunitaria nei bambini nei confronti del vaccino dell’epatite B. La somministrazione all’età di 6 mesi di una combinazione di 4 ceppi microbici (L. rhamnosus GG, L. rhamnosus LC705, B. breve Bbi99 e Propionibacterium freudenreichii spp. shermanii JS) non ha portato ad un miglioramento significativo della risposta anticorpale nel confronti del vaccino trivalente contro difterite, tetano e Haemophilus influenzae. Anche il ceppo B. breve BBG-01 ha mostrato un blando effetto adiuvante contro il vaccino anti-colera. I microrganismi probiotici sono coinvolti nell’induzione della tolleranza immunitaria, ma come questo avvenga è ancora tutto da chiarire. Sembra che siano implicate delle specifiche proteine dello strato superficiale dei batteri, come la proteina SlpA del Lactobacillus acidophilus NCFM. L’interazione di questa proteina con uno specifico recettore localizzato sulle cellule dendritiche del sistema immunitario, che si riflette in una maggior produzione da parte dei linfociti T di IL-4 piuttosto che di IFN-g, determina il bilancio Th1/Th2 fenomeno alla base della tolleranza immunitaria (Konstantinov et al., 2008). A modulare in modo differente la risposta immunitaria è anche il profilo delle sostanze rilasciate dai microrganismi, che è caratteristico per ciascun ceppo. In uno studio in cui le proprietà immunologiche di 3 differenti ceppi di lattobacilli (L. plantarum NCIMB8826, L. rhamnosus GG (LGG), L. paracasei B21060) sono state confrontate in esperimenti sia in vitro che in vivo con quelle del microrganismo patogeno, Salmonella typhimurium SL1344, L. plantarum e LGG hanno mostrato un profilo in citochine simile a quello di Salmonella, con produzione da parte delle cellule dendritiche di citochine infiammatorie come IL-12p70, TNF-a e IL-10. Il rilascio di queste sostanze da parte di L. paracasei è stato minore a suggerire un effetto immunomodulante contro quello immunostimolante mostrato dagli altri lattobacilli in studio. Le differenti proprietà immunologiche di questi 3 ceppi sono state confermate in un modello animale di colite, nel quale solo la somministrazione di L. paracasei ha avuto effetti protettivi contro l’esacerbazione della malattia osservata con L. plantarum e LGG (Mileti et al., 2009)
Uno studio in vitro in cui cellule della frazione mononucleata del sangue periferico sono state incubate con due differenti ceppi probiotici, ha evidenziato risposte immunitarie diverse: il Lactobacillus pentosus (LPS01), stimolando la secrezione di TNFa e IFNg, devia la risposta dei linfociti T verso Th1, mentre con il Lactobacillus plantarum (LP01) la maggior produzione delle citochine IL-4 e IL-10 sposta l’equilibrio Th1/Th2 verso la predominanza di Th2. In uno studio condotto in doppio cieco con il controllo del placebo, una combinazione di L. plantarum LP01 e B. breve BR03, assunta per circa un mese, è risultata significativamente più efficace di una miscela costituita da L. plantarum LP01 e L. acidophilus LA02, nel ridurre il dolore associato alla sindrome del colon irritabile (tutti i ceppi sono stati assunti in quantità pari a 5 x 10alla9 UFC/die). Anche altri sintomi (costipazione, diarrea, flatulenza, gonfiore, etc.) sono migliorati maggiormente abbinando a L. plantarum LP01 il B. breve BR03 piuttosto che il L. acidophilus LA02 (Nicola et al., 2010). Alcuni ceppi probiotici associati a sostanze prebiotiche (FOS, fruttoligosaccaridi; GOS, galattoligosaccaridi), oltre a ridurre il gonfiore intestinale e a regolarizzare la funzione intestinale, si sono dimostrati efficaci contro le malattie da raffreddamento, riducendo le infezioni del tratto respiratorio sia numericamente che in termini di severità e durata degli episodi (Pregliasco et al., 2008).
Oggi la nuova sfida dei probiotici è il miglioramento delle prestazioni sportive, dove si hanno già le prime prove di efficacia. L’esercizio fisico, infatti, se praticato intensamente può portare ad una diminuzione delle difese immunitarie (in particolare si assiste ad una riduzione delle cellule NK “natural killer”) aumentando la suscettibilità degli atleti alle infezioni respiratorie soprattutto durante le sedute intensive di allenamento nei mesi freddi. L’assunzione di un latte fermentato con uno specifico ceppo di L. casei da parte di atleti si è dimostrata efficace nel contrastare la riduzione dell’attività immunitaria delle cellule NK, diminuendo pertanto l’incidenza di malattie respiratorie in questi soggetti (Pujol et al., 2000). Risultati incoraggianti in tal senso sono stati tratti anche da uno studio in doppio cieco con il controllo del placebo condotto nel 2003 dall’Istituto australiano dello sport (AIS) in cui, durante il programma intensivo di allenamento invernale, gli atleti trattati per 2 mesi con un particolare ceppo di L. fermentum, hanno avuto rispetto a quelli del gruppo placebo 42 giorni in meno di malattia. Risultati simili sono stati ottenuti in un studio che AIS ha svolto in collaborazione con l’Università di Newcastle in Inghilterra, in cui in atleti affaticati, diventati più suscettibili a infezioni del tratto respiratorio superiore spesso dovuti alla riattivazione del virus di Epstein Barr e nei quali si è osservata una ridotta secrezione di IFNg da parte dei linfociti T CD4+, l’assunzione per un mese di uno specifico ceppo di L. acidophilus ha portato ad un significativo incremento della concentrazione nella saliva di IFNg e IgA (Clancy et al., 2006). Nel 2011, in uno studio in cui 99 ciclisti professionisti sono stati randomizzati a ricevere, per un periodo di 11 settimane, 10alla9 UFC/die di un particolare ceppo di L. fermentum, si è osservato durante l’allenamento un miglioramento dei disturbi gastrointestinali e delle infezioni respiratorie, soprattutto nei maschi, in termini di durata e gravità dei sintomi (West et al., 2011).L’ EFSA ha finora respinto tutti i claims salutistici riguardanti i microrganismi probiotici, sebbene ben caratterizzati, per mancanza di evidenze scientifiche consistenti. Nel 2015, EFSA ha pubblicato i risultati di una consultazione pubblica per la revisione delle linee guida sui requisiti scientifici necessari per supportare le indicazioni sulla salute dei probiotici relative a funzione intestinale e immunitaria, nella quale si evidenzia che, oltre alla corretta identificazione del ceppo e all’idoneità della popolazione cui il prodotto è destinato, per poter giungere ad una opinione positiva, il claim dovrebbe essere riferito ad una specifica funzione del corpo e deve essere sufficientemente specifico per poter essere verificato e misurato in vivo nell’uomo attraverso metodi analitici generalmente accettati.
Un trial clinico in doppio cieco con il controllo del placebo condotto in Cina su un gruppo di 326 bambini di età 3-5 anni, ha dimostrato che l’assunzione di una combinazione di L. acidophilus e B. animalis subsp lactis Bi-07, ad una dose di 5 x 10alla9 UFC due volte al giorno per 6 mesi, ha portato, rispetto alla sola somministrazione di L. acidophilus NCFM, ad una maggior riduzione delle malattie respiratorie (febbre, raffreddore, tosse, etc.) in termini sia numerici che di durata degli episodi. In questi bambini è stato rilevato un minor ricorso alle cure antibiotiche e un ridotto numero di assenze a scuola (Leyer et al., 2009). La stessa miscela di ceppi probiotici, assunta per un periodo di 5 mesi, è risultata invece inefficace in un gruppo di individui adulti per i quali tra i criteri di selezione per lo studio era compreso lo svolgimento di attività fisica per almeno mezz’ora 3 volte alla settimana. Nei soggetti trattati con uno specifico ceppo di B. animalis si è invece registrata, rispetto al placebo, una riduzione pari al 27% del rischio di contrarre un’infezione del tratto respiratorio superiore (West et al., 2014). Un modello di studio virtuale sviluppato a partire da due studi di metanalisi sugli effetti benefici dei probiotici nel ridurre l’incidenza delle malattie di raffreddamento, è stato messo a punto per studiare l’impatto sulla salute pubblica, anche in termini economici, derivante dal consumo di probiotici nella popolazione francese. Tale modello ha evidenziato che se tutti gli abitanti della Francia (65 milioni) assumessero probiotici si avrebbero in generale 6,6 milioni di giorni in meno di infezioni del tratto respiratorio, 473 mila prescrizioni in meno di antibiotici, 1.45 milioni in meno di giorni di malattia, un risparmio in termini economici di 254 milioni di euro per la società, 131 milioni di euro per le famiglie e 37,7 milioni per il sistema sanitario nazionale (Lenoir-Wijnkoop et al., 2015.
Ci sono poi esempi di come specifici ceppi microbici, dimostratisi efficaci in precedenti studi sull’animale o nell’uomo, sono in grado di modulare la risposta immunitaria della cellula ospite opportunamente stimolata dall’acido polinosinico-policitidilico Poly(I·C), un ligando sintetico dell’acido nucleico virale dsRNA, utilizzato per stimolare la risposta immunitaria antivirale. Con questo modello è stato, ad esempio, studiato un prodotto disponibile sul mercato contenente 3 specifici ceppi batterici (L. helveticus R0052, B. longum subsp. infantis R0033, and B. bifidum R0071) che, in trials clinici precedenti, hanno mostrato effetti benefici contro le malattie da raffreddamento e le infezioni da rotavirus. Nello specifico è stato utilizzato un modello in vitro di cellule HT-29 di adenocarcinoma del colon umano che, opportunamente stimolate da Poly(I·C), aumentano l’espressione dei recettori TLR3, RIG-I, MDA5 e della protein chinasi attivata da dsRNA virale. L’interazione di Poly(I·C) con tali recettori porta all’aumentata trascrizione di geni che codificano per interferoni (IFN), citochine/chemochine coinvolti nell’immunità innata e nella risposta proinfiammatoria Th1. Il monitoraggio dell’espressione genica in due differenti condizioni, stimolazione da parte di Poly(I·C) da solo o in combinazione con i 3 specifici ceppi batterici, è stato effettuato con la metodica analitica dell’immunoarray, che consente di analizzare in una sola volta gli RNA prodotti da migliaia di geni. Quando le cellule HT-29 sono state incubate con Poly(I·C) e i 3 ceppi probiotici, oltre alla mancata attivazione di specifici geni antivirali, si è assistito ad una significativa attenuazione della risposta proinfiammatoria Th1 per inibizione dell’espressione di alcuni geni. L’insieme dei 3 ceppi microbici, per la loro sinergia, si è mostrata più efficace nell’attenuare la risposta proinfiammatoria rispetto ai probiotici testati singolarmente. Questa metodica analitica, attraverso l’analisi dell’espressione genica, rappresenta uno strumento innovativo per scoprire quali sono i meccanismi attraverso i quali i probiotici sono in grado di modulare il sistema immunitario e per identificare quali markers proteici misurare per valutare la risposta immunitaria in studi clinici.
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